導(dǎo)語(yǔ)：甘草總黃酮含量測(cè)定論文一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【摘要】目的選擇適宜的對(duì)照品，建立能夠準(zhǔn)確測(cè)定甘草中總黃酮含量的方法。方法針對(duì)甘草苷、柚皮苷、蘆丁3種對(duì)照品分別使用紫外分光光度法，通過(guò)全波長(zhǎng)掃描，比較不同對(duì)照品和樣品與顯色前后的最大吸收波長(zhǎng)，從而確定適合的對(duì)照品。結(jié)果甘草苷對(duì)照品和樣品液經(jīng)過(guò)堿處理后最大吸收波長(zhǎng)分別為334，334.5nm且全波長(zhǎng)掃描后得到峰形基本一致，而柚皮苷對(duì)照品經(jīng)過(guò)相同處理后最大吸收波長(zhǎng)在419.5nm，蘆丁對(duì)照品和樣品分別經(jīng)過(guò)Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2顯色后最大吸收波長(zhǎng)在510nm和363nm。通過(guò)對(duì)3種方法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以甘草苷為對(duì)照品的測(cè)定結(jié)果分別與另外兩種方法差異顯著。結(jié)論選用甘草苷為對(duì)照品應(yīng)用于紫外分光光度法測(cè)定甘草總黃酮成分準(zhǔn)確度較高，是切實(shí)可行的含量測(cè)定方法。

【關(guān)鍵詞】甘草黃酮紫外分光光度法

Abstract:ObjectiveToselecttheappropriatestandardfordeterminationofflavonoidsinGlycyrrhiza.MethodsTocomparethelargestabsorptionwavelengthbywavelengthscanningofultravioletspectrophotometry.ResultsStandardLiquiritinandsamplesprocessedbyalkalihadthelargestabsorptionatthe334nmand334.5nmwavelength,andstandardNaringinatthe419.5nmwavelength.ConclusionTodeterminecontentofflavonoidsinglycyrrhizawithultravioletspectrophotometrybystandardLiquiritinisapracticalmethodwithhigheraccuracy.

Keywords:Glycyrrhiza;Flavonoids;Ultravioletspectrophotometry

甘草中的黃酮類成分包括黃酮類、二氫黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮類和雙黃酮類［1］化合物，其中以二氫黃酮類和查爾酮類含量較高［2］。二氫黃酮類包括：甘草苷(liquiritin)、甘草苷元(liquiritigenin)、新甘草苷(neoliquiritin)、甘草素（liquiritigenin）等，查爾酮類包括：異甘草苷(isoliquiritin)、異甘草素（isoliquiritigenin）、異甘草苷元(isoliquiritigenin)、新異甘草苷(neoisoliquiritin)等［3～7］。而其中比例較大的成分以甘草苷為主［8］。

甘草總黃酮的測(cè)定常用蘆?。?～10］、柚皮苷［11～13］為對(duì)照品通過(guò)紫外分光光度法進(jìn)行測(cè)定，而《中國(guó)藥典》中甘草項(xiàng)下沒(méi)有規(guī)范總黃酮成分含量的測(cè)定方法［14］，導(dǎo)致甘草總黃酮成分有多種不同的測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)對(duì)不同測(cè)定方法進(jìn)行考察，比較不同對(duì)照品和樣品采用相應(yīng)方法顯色后的最大吸收波長(zhǎng)，對(duì)3種對(duì)照品相應(yīng)測(cè)定結(jié)果分析，確定最適宜甘草總黃酮含量測(cè)定的對(duì)照品和測(cè)定方法。

1器材

1.1儀器HITACHIU-2000Spectrophotometer。

1.2樣品甘草生藥樣品由北京中醫(yī)藥大學(xué)王文全教授提供和鑒定,全部為甘草GlycyrrhizauralensisFisch（樣品按來(lái)源依次編號(hào)為1.杭錦旗1年生；2.杭錦旗2年生；3.杭錦旗3年生；4.杭錦旗4年生；5.杭錦旗5年生；6.新疆烏蘇3年生；7.杭錦旗野生；8.杭錦旗野生橫生莖；9.甘肅金塔野生；10.寧夏鹽池野生；11.甘肅酒泉野生；除杭錦旗野生橫生莖外其余10份樣品均為根）。

1.3試劑供含量測(cè)定用甘草苷（編號(hào)：111610）、柚皮苷（編號(hào)：110722）：中國(guó)藥品生物制品檢定所；蘆丁對(duì)照品由北京中醫(yī)藥大學(xué)馬長(zhǎng)華教授制備；氫氧化鉀(AR)、甲醇(AR)、硝酸鋁（AR）、亞硝酸鈉（AR）、氫氧化鈉（AR）。

2方法

2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱定甘草苷、柚皮苷、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品適量,用甲醇溶解,分別定容于25，10，10ml容量瓶中,制得濃度為0.07504g·L-1的甘草苷對(duì)照品溶液、0.968g·L-1的柚皮苷對(duì)照品溶液和1.003g·L-1的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.2樣品的提取取甘草粉末適量,精密稱定,加甲醇50ml,稱重,（250W,20kHz）超聲提取80min,稱重,補(bǔ)足損失重量,過(guò)濾,收集續(xù)濾液,即得。

2.3測(cè)定方法

2.3.1甘草苷為對(duì)照品的測(cè)定方法精確吸取提取液0.5ml,加入1ml甲醇,其中一份加入10%KOH溶液0.5ml顯色,室溫放置5min,用甲醇稀釋至10ml，以相應(yīng)溶劑為空白，在λ334nm處測(cè)定吸收度。

2.3.2柚皮苷為對(duì)照品的測(cè)定方法供試液制備同“2.3.1”項(xiàng)，在波長(zhǎng)419nm處測(cè)定吸收度。

2.3.3蘆丁為對(duì)照品的測(cè)定方法精確吸取提取液0.5ml，加3ml蒸餾水，5%亞硝酸鈉溶液0.5ml放置6min，加10%硝酸鋁溶液0.5ml，混勻后放置6min，加5%氫氧化鈉2.5ml混勻，放置15min后蒸餾水定容至10ml。以相應(yīng)溶劑為空白，在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸收度。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1以甘草苷為對(duì)照品方法學(xué)考察甘草苷方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：精確吸取甘草苷對(duì)照品溶液0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5ml置6個(gè)10ml容量瓶中,按“2.3.1”項(xiàng)下操作。以吸收度A為縱坐標(biāo),對(duì)照品的濃度C(mg/ml)為橫坐標(biāo),得線性回歸方程:y=66.753x-0.0178,r=0.9999,線性范圍為18.76～112.56μg。顯色30min內(nèi)穩(wěn)定。

甘草苷方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取6份新疆烏蘇3年生人工栽培甘草粉末按“2.2”項(xiàng)下制備，按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。黃酮平均含量為3.33%，RSD=3.23%,（n=5）。

甘草苷方法加樣回收率實(shí)驗(yàn)：取5份新疆烏蘇3年生人工栽培甘草粉末按“2.2”項(xiàng)下制備后分別精密量取已知總黃酮含量的提取液0.5ml，加入一定量甘草苷對(duì)照品溶液，λ334nm處測(cè)定吸收度。計(jì)算回收率,結(jié)果平均為98.7%,RSD=2.0%,（n=5）。

2.4.2另外兩種測(cè)定方法的方法

學(xué)考察柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線以吸收度A為縱坐標(biāo),對(duì)照品的質(zhì)量m（mg）為橫坐標(biāo),得線性回歸方程y=0.0048x-0.0157，r=0.9993，線性范圍48.4～290.4mg，重現(xiàn)性RSD=1.38%（n=5），加樣回收率98.73%RSD=1.35%（n=5）；顯色30min內(nèi)穩(wěn)定。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線：以吸收度A為縱坐標(biāo),對(duì)照品的質(zhì)量m（mg）為橫坐標(biāo),得線性回歸方程y=1.3163x-0.0063,r=0.9987，線性范圍0.1003～0.6018mg，重現(xiàn)性RSD=0.97%（n=5），加樣回收率101.35%RSD=3.57%（n=5）。顯色30min內(nèi)穩(wěn)定。

3結(jié)果和討論

3.1不同對(duì)照品吸收峰比較分析通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得甘草提取液樣品經(jīng)KOH顯色后的最大吸收波長(zhǎng)在334.4nm（圖1），甘草苷對(duì)照品KOH顯色后于200～500nm波長(zhǎng)處掃描,最大吸收波長(zhǎng)在334nm左右（圖2），二者相符。

柚皮苷經(jīng)過(guò)KOH顯色后于200～500nm波長(zhǎng)處掃描，最大吸收283.5nm紅移到419.5nm（見(jiàn)圖3），與樣品顯色后最大吸收波長(zhǎng)不一致。

樣品通過(guò)Al2(NO3)3-NaOH-NaNO2方法顯色后最大吸收波長(zhǎng)在363nm處（見(jiàn)圖4），蘆丁對(duì)照品通過(guò)Al2（NO3）3-NaOH-NaNO2方法顯色后最大吸收波長(zhǎng)在510nm左右，兩者相距甚遠(yuǎn)。

3.2不同對(duì)照品方法實(shí)測(cè)結(jié)果比較分析對(duì)11份樣品依“2.2”項(xiàng)下制備，分別依據(jù)甘草苷、柚皮苷和蘆丁的顯色方法在不同波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。表13種方法總黃酮含量測(cè)定結(jié)果（略）

通過(guò)使用SPSS10.0對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析，3種方法測(cè)定結(jié)果方差分析F值17.845，P≈0.000說(shuō)明3種方法測(cè)定結(jié)果有差異，兩兩比較結(jié)果見(jiàn)表2。表2不同方法測(cè)定結(jié)果間黃酮含量均數(shù)的兩兩比較（略）

按α=0.05水準(zhǔn)，柚皮苷方法和蘆丁方法測(cè)定的黃酮含量均數(shù)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而甘草苷方法分別與其他兩種方法測(cè)定結(jié)果差異顯著。柚皮苷和蘆丁方法測(cè)定結(jié)果分別較甘草苷方法測(cè)定結(jié)果低29.6%和28.1%。

3.3超聲提取時(shí)間考察在確定對(duì)照品等方法的基礎(chǔ)上我們對(duì)樣品提取時(shí)間進(jìn)行了考察，分別對(duì)超聲50，60，70，80，90，100min的樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)黃酮百分含量與時(shí)間關(guān)系如圖6，隨著時(shí)間的增加，黃酮百分含量有所提高，但達(dá)到80min后，升高趨勢(shì)明顯變緩，考慮到實(shí)驗(yàn)效率和成本，我們采用80min作為提取時(shí)間。

4討論

在對(duì)照品的選擇上,由于蘆丁屬于黃酮類化合物（結(jié)構(gòu)為5、7、3''''、4''''-四羥基黃酮-3-蕓香糖苷）,甘草中黃酮成分主要為二氫黃酮,其次為查爾酮,蘆丁在結(jié)構(gòu)上差異較大,因此不適合用于甘草總黃酮成分測(cè)定。柚皮苷（結(jié)構(gòu)為5、7、4''''-三羥基二氫黃酮）雖然是二氫黃酮類化合物，但同甘草苷(結(jié)構(gòu)為7-羥基二氫黃酮-4''''-葡萄糖苷)相比，除都具有7位羥基外，還有5位的游離羥基，且4''''位的羥基是游離的，未結(jié)合成苷，結(jié)構(gòu)上的差異，導(dǎo)致與堿反應(yīng)后最大吸收波長(zhǎng)紅移不一致，我們采用黃酮中含量最多的甘草苷為對(duì)照品，利用二氫黃酮與堿反應(yīng)后生成查爾酮，由于帶I吸收較弱，不靈敏，因此用帶II最大吸收紅移到330nm左右進(jìn)行黃酮成分的含量測(cè)定。

在選定以甘草苷為對(duì)照品的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步進(jìn)行了顯色方法的考察，嘗試鹽酸鎂粉法進(jìn)行測(cè)定，考察了鎂粉用量、加熱時(shí)間和溫度對(duì)顯色的影響，發(fā)現(xiàn)同樣條件顯色后甘草苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均在560nm左右有一吸收峰，然而樣品在467nm處一吸收峰對(duì)其造成干擾（見(jiàn)圖5）。

黃酮作為重要的藥效組分在甘草中有著豐富的種類和較高的含量，如果不采用適宜的測(cè)定方法會(huì)使結(jié)果偏離真實(shí)值，從而影響我們對(duì)甘草質(zhì)量客觀真實(shí)的評(píng)價(jià)。

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