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摘要摘要：目的觀察飼料中添加?；撬?/a>對光化學損傷后大鼠光感受器細胞凋亡的影響，并進一步從氧化應激基因cfos表達變化角度探索其防護機制。方法70只SD大鼠隨機分為對照組、牛磺酸組。分別喂飼標準飼料或添加4％?；撬犸暳衔癸?5d后接受(3000±200)lx持續(xù)0，1，3，6，9，12,24h光照，凋亡細胞原位末端標記法(TUNEL)檢測光感受器細胞凋亡情況并計算凋亡指數(shù)(AI)；RTPCR法及免疫印跡法檢測視網(wǎng)膜內(nèi)cfosmRNA以及蛋白表達水平。結果感光細胞凋亡指數(shù)隨光照時間延長逐漸增加，?；撬峤MAI顯著低于對照組(P%26lt;005)，其中光照12h?；撬峤M和對照組AI分別為(123±47)％和(324±62)％；視網(wǎng)膜cfosmRNA光照1h后一過性表達增高，?；撬峤M較對照組低(P%26lt;005)；光照后視網(wǎng)膜cfos蛋白表達逐漸升高，于3h達峰值，?；撬峤M顯著低于對照組(P%26lt;005)。結論在視網(wǎng)膜光化學損傷條件下，牛磺酸可能通過抑制視網(wǎng)膜cfos的轉(zhuǎn)錄及表達，阻斷光感受器細胞凋亡轉(zhuǎn)導從而保護視網(wǎng)膜。

摘要：?；撬?；視網(wǎng)膜光化學損傷；凋亡細胞；cfos

Effectsoftaurineoncfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage

Abstract摘要：ObjectiveToobservetheeffectofdietarysupplementationwithtaurineonphotoreceptorapoptosisandfurtherinvestigatechangesofcfosexpressionofratretinaafterphotochemicaldamage.MethodsSeventyratswererandomlydividedintocontrolgroup(Control)and4%taurinesupplementationgroup(Taurine).Thesubjectswereexposedto(3000±200)lxtransmittedbysixcoldwhitelightsfor0,1,3,6,9,12,24h.TheapoptoticphotoreceptorcellsweredetectedusingTUNELmethod;TotalRNAandproteinofretinawereextracted;relativecfosmRNAlevelsweredeterminedusingRT-PCRandcfosproteinlevelsweredetectedbywestern-blotanalysis.ResultsWiththelightexposuretimeprolonged,apoptosisindex(AI)ofphotoreceptorcellswaselevated,amongwhichtheAIof12hwere(12.3±4.7)%and(32.4±6.2)%inTaurineandcontrolgroup(P%26lt;0.05).ThecfosmRNAofratretinawastransientlyinducedafterone-hourlightexposureanditwaslowerintaurinegroup(P%26lt;0.05);cfosproteinlevelincreasedafterthreehourexposureanditwaslowerintaurinegroup(P%26lt;0.05).ConclusionTaurinecanpartlyreducethetranscriptionandtranslationofc-fos,whichwouldfurtherinhibittheapoptosissignaltransductionandprotecttheratretinafromphotochemicaldamage.

Keywords摘要：taurine;photochemicaldamage;apoptoticcell;cfos

視網(wǎng)膜是視覺形成的重要組織結構，若光照時間或光照強度等超過視網(wǎng)膜承受力，則會導致光化學損傷〔1〕，損傷早期視功能減退，光感受器細胞丟失，后期內(nèi)層神經(jīng)元變性壞死，最終導致失明〔12〕。近年探究認為，凋亡是視網(wǎng)膜光化學損傷中光感受器細胞丟失的主要機制〔1,3〕，持續(xù)高強度光照使視網(wǎng)膜內(nèi)自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物激增，同時氧化應激基因AP1表達上調(diào)促進凋亡信號轉(zhuǎn)導，且證實其亞單位cfos是必需調(diào)控因子。?；撬岷鸵暰W(wǎng)膜生長發(fā)育和功能維持關系密切，前期實驗已證實，4％?；撬崮苡行ПＷo光化學損傷條件下的大鼠視網(wǎng)膜〔4〕。本探究擬進一步觀察其對光感受器細胞凋亡的影響，并從cfos表達變化角度探索防護機制。

1材料和方法

11實驗動物及分組清潔級SD大鼠(第三軍醫(yī)大學第三附屬醫(yī)院動物中心)70只，體重150g左右，雌雄各半。隨機分為對照組、牛磺酸組，分別喂飼標準飼料或添加4％?；撬?北京世紀維他生物技術有限公司，純品)飼料15d后，各組5只大鼠分別接受(3000±200)lx持續(xù)0，1，3，6，9，12，24h光照。

12凋亡細胞的原位末端標記法(TUNEL)檢測光感受器細胞凋亡情況大鼠光照后立即取出眼球，4％多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟切片，TUNEL試劑盒(德國Roche公司)檢測視網(wǎng)膜光感受器細胞凋亡情況參照試劑說明書，計數(shù)10個油鏡視野下每張切片TUNEL陽性細胞數(shù)，其和光感受器細胞總數(shù)比值為光感受器細胞凋亡指數(shù)(AI)。

13視網(wǎng)膜總RNA提取及RTPCR大鼠光照后立即取出眼球，解剖顯微鏡下小心剝離視網(wǎng)膜，參考Trizol試劑說明書常規(guī)提取總RNA，核酸蛋白檢測儀測定其含量和純度。-20℃保存?zhèn)溆谩TPCR按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行，以大鼠βactin為內(nèi)參，上游引物序列為5′GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3′，下游引物序列為5′GCCAGGATAGAGCCACCAAT-3′，退火溫度為554℃，產(chǎn)物長度為684bp；cfos上游引物序列為5′GCCTTTCCTACTACCATTCC-3′，下游引物序列為5′ATCTTATTCCTTTCCCTTCG-3′，退火溫度為533℃，產(chǎn)物長度為370bp。擴增條件為94℃5min40s，各退火溫度45s，循環(huán)32次，72℃10min。2％瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)掃描以及分析。PCR特異條帶以相對吸光度×面積(mm2)表示，以各組的校正吸光度和其βactin校正吸光度的比值表示(V)。

14免疫印跡法測定視網(wǎng)膜cfos蛋白表達情況大鼠光照后立即取出眼球，剝離視網(wǎng)膜，常規(guī)方法提取總蛋白，Lowry法定量?？偟鞍?40μg)經(jīng)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)(5％積層膠、12％分離膠)后，采用BioRad半干轉(zhuǎn)印儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，利用cfos多克隆抗體(1摘要：150稀釋，北京中杉生物制劑公司)檢測膜上蛋白。BioRad凝膠成像分析系統(tǒng)分析相對表達量，以0h組蛋白表達量為內(nèi)參，其他各個時相點灰度值和內(nèi)參比值為相對灰度值(A)。

15統(tǒng)計分析采用SPSS100統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2結果

21?；撬釋庹蘸蟠笫笠暰W(wǎng)膜光感受器細胞凋亡的影響對照組光照6h后，發(fā)現(xiàn)棕褐色TUNEL陽性細胞散在分布于外核層(ONL)內(nèi)部，即受損的多為視桿細胞，而牛磺酸組光照9h后才開始出現(xiàn)陽性細胞，隨光照時間延長，陽性感光細胞增多，光照24h后視網(wǎng)膜內(nèi)核層、節(jié)細胞層也出現(xiàn)大量陽性細胞(圖1)。光化學損傷后AI隨光照時間延長逐漸增高，?；撬峤M光照12hAI值(123±47)％顯著低于對照組(324±62)％，其他時相點也顯著低于對照組(P%26lt;005)。

A摘要：對照組，光照0h；B摘要：對照組，光照9h；C摘要：?；撬峤M，光照9h

圖1?；撬釋饣瘜W損傷后大鼠視網(wǎng)膜光感受器凋亡的影響(TUNEL，×400)（略）

22?；撬釋庹蘸蟠笫笠暰W(wǎng)膜cfos轉(zhuǎn)錄以及表達的影響

221牛磺酸對光照后大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA表達的影響光照后對照組和?；撬峤M大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA表達均出現(xiàn)一過性增高，且在光照1h達到峰值，隨著光照時間延長其表達逐漸降低，于6h光照后其表達量接近未光照水平(圖2)。利用灰度掃描計算V值發(fā)現(xiàn)，光照1h時?；撬峤M大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA較對照組表達低(P%26lt;005)。

222牛磺酸對光照后大鼠視網(wǎng)膜cfos蛋白表達的影響光照后2組動物視網(wǎng)膜cfos蛋白表達逐漸增高，于光照3h達到峰值，隨光照時間延長其表達量逐漸降低，光照12h其表達量接近未光照時水平(圖3)。A分析提示?；撬峤M3h蛋白表達相對量比對照組低(P%26lt;005)。

D摘要：對照組；T摘要：?；撬峤M

圖2不同光照時間對大鼠視網(wǎng)膜cfosmRNA表達的影響（略）

D摘要：對照組；T摘要：?；撬峤M

圖3不同光照時間對大鼠視網(wǎng)膜中cfos蛋白表達的影響（略）

3討論

視網(wǎng)膜光化學損傷后光感受器細胞丟失的機制尚存在一定的爭議，但大部分探究者認為，凋亡是光化學損傷以及其他視網(wǎng)膜變性疾病光感受器細胞丟失的主要機制〔3，5〕。本探究在前階段證實，4%?；撬崮苡行ПＷo持續(xù)高強度光照〔(3000±20)lx，24h〕條件下大鼠視網(wǎng)膜基礎上，結合凋亡細胞生化特征，采用TUNEL法檢測凋亡細胞。實驗結果提示，?；撬釡p少了光照不同時相點凋亡指數(shù)，和其他探究報道〔6，7〕?；撬峋哂锌股窠?jīng)元凋亡功能相符。近年探究發(fā)現(xiàn)，AP1是調(diào)控光感受器細胞凋亡的重要影響因子，其亞基cfos是必需的調(diào)控因子〔3，8〕。AP1參和了許多生理過程如細胞增殖、分化、死亡及惡性轉(zhuǎn)化等，脂多糖、氧化應激、紫外線等均能增加其活性，并通過調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮功能〔7〕，其中，cjun／cfos二聚體形式的AP1復合物生物活性最強〔6〕。光損傷條件下cfos(-／-)大鼠光感受器細胞幾乎未丟失，以及大鼠、小鼠和661W光感受器細胞短期光照后cfosmRNA表達一過性增高，均說明cfos在光誘導光感受器細胞凋亡中促進凋亡功能〔3，8〕。本探究發(fā)現(xiàn),?；撬峤McfosmRNA以及蛋白表達峰值均比對照組低，推測?；撬峥赡芡ㄟ^抑制cfos表達，導致整個AP1復合物減少，阻斷凋亡信號轉(zhuǎn)導，從而有效保護光感受器細胞。文獻報道，TauCl能降低FLS細胞AP1活性，而?；撬岵荒堋?〕。因此，?；撬峥赡芡ㄟ^捕捉次氯酸(HOCI)形成TauC1，TauCl才是?；撬岬幕钚孕问?，上述推論還需進一步證實。

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