導(dǎo)語(yǔ)：生長(zhǎng)抑素類似物對(duì)人肝癌細(xì)胞株MHCC97一文來(lái)源于網(wǎng)友上傳，不代表本站觀點(diǎn)，若需要原創(chuàng)文章可咨詢客服老師，歡迎參考。

【關(guān)鍵詞】MHCC97

InfluenceofsomatostatinanalogueonhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97H

【Abstract】AIM:TostudytheinfluenceofsomatostatinanalogueoctreotideonhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97Handitsmechanismsinvivo.METHODS:Twentysevennudemice,ofwhichMHCC97Htumormasswasplantedinliver,weredividedinto3groupsrandomly:negativecontrolgroup,lowdoseinterferedgroup,largedoseinterferedgroup,andraisedatsimilarconditionfor35dthesurvivaltime,theweightatthedeathpointwereracordedandthepathologicailchangesofliversandlungswerechanged;theexpressionofmatrixmetalloproteinases2（MMP2）inhepatocellularcarcinomawasdetectedbyimmunohistochemicaltechnique.RESULTS:Comparedwiththeanimalmodelsofnegativecontrolgroup,theanimalmodelsofinterferedgroupswereheavierinmeanweightatdeathpointandlowerinmetastasisrate(P<0.05);whiletherewasnostatisticaldifferencebetweenthe2interferedgroups(P>0.05);theexpressionofMMP2inhepatocellularcarcinomaofinterferedgroupswasgraduallyincreasedthanthatincontrolgroup（P<0.05）;whiletherewasnostatisticaldifferencebetweeninterferedgroups(P>0.05).CONCLUSION:OctreotidecanimprovethelivingqualityofanimalmodelsandinhibitthemetastasisofhumanhepatocellularcancercelllineMHCC97Hinvivo,whichmightberelatedtothedownregulationoftheexpressionofMMP2.

【Keywords】MHCC97H,octreotide,inhibition

【摘要】目的：探討生長(zhǎng)抑素類似物奧曲肽對(duì)人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株mhcc97H的影響及可能機(jī)制.方法：MHCC97H腫瘤組織種植于裸鼠肝臟建立肝癌動(dòng)物模型27只，隨機(jī)分為3組：陰性對(duì)照組和小、大劑量干預(yù)組，同等條件下飼養(yǎng)35d，記錄動(dòng)物模型生存期，死亡時(shí)質(zhì)量；觀察肝臟，肺臟病理改變；免疫組化方法檢測(cè)肝臟腫瘤組織基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)表達(dá)變化.結(jié)果：奧曲肽干預(yù)組動(dòng)物模型較陰性對(duì)照組動(dòng)物模型死亡時(shí)平均體重增加,肝癌轉(zhuǎn)移率下降(P<0.05)；干預(yù)組間對(duì)比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；免疫組化顯示干預(yù)組肝臟腫瘤細(xì)胞MMP2表達(dá)較陰性對(duì)照組下調(diào)（P<0.05）；干預(yù)組組間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).結(jié)論：奧曲肽可改善荷MHCC97H細(xì)胞裸鼠肝癌模型生存質(zhì)量，抑制MHCC97H細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移，下調(diào)腫瘤組織MMP2的表達(dá)是奧曲肽抑制MHCC97H細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制之一.

【關(guān)鍵詞】MHCC97H細(xì)胞株；奧曲肽；抑制

0引言

原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(primaryhepatocellularcarcinoma,PHC)PHC根治性切除后5a復(fù)發(fā)率為54.1%～61.5%，小肝癌(≤5cm)為43.5%，而局部治療的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率則更高.常規(guī)化療及放療效果不佳，副作用大，基因治療、生物治療等作用亦不明顯.因此，深入研究肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)機(jī)制和積極探索有效的抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療措施是當(dāng)前PHC診治中的重點(diǎn)和難點(diǎn).

1材料和方法

1.1材料主要試劑和儀器:善寧注射液(0.1mg/支)由瑞士諾華公司生產(chǎn)提供.鼠抗人MMP2抗體AntibodyDiagnosticaInc.

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株MHCC97H由上海中山醫(yī)院腫瘤研究所購(gòu)得，100mL/L胎牛血清（fetalcalfserum,FCS）加達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbeccosmodifiedeaglesmedium,DMEM）于50mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)37℃，50mL/LCO2及飽和濕度下CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng).

1.2.2動(dòng)物模型取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC97H肝癌細(xì)胞株，充分吹打至單細(xì)胞懸液，細(xì)胞沖洗液沖洗3次，DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至2×107/mL，取0.2mL于4～6周齡的雄性裸鼠背部皮下注射，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于層流室內(nèi)飼養(yǎng)28d，至皮下結(jié)節(jié)直徑約1cm，無(wú)菌條件下取出腫瘤組織保存于37℃含20g/LFCS的DMEM中，粉碎至2mm×2mm×2mm.4～6周齡的雄性裸鼠30只，戊巴比妥鈉45mg/kg腹腔注射麻醉后，手術(shù)野皮膚消毒，左肋緣下斜切口進(jìn)腹，顯露肝左葉，腫瘤組織塊2mm×2mm×2mm大小，接種于肝左外葉，壓迫止血，關(guān)腹.同等條件下，動(dòng)物模型層流室內(nèi)飼養(yǎng)3d，剔除因麻醉意外、感染及出血死亡動(dòng)物模型3只，余動(dòng)物模型隨機(jī)分為3組，動(dòng)物模型體質(zhì)量及周齡組間均衡性檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.A組：陰性對(duì)照組（等體積生理鹽水腹腔注射，n=8）；B組：小劑量干預(yù)組（Oct50μg/kg・d腹腔注射，n=9）；C組：大劑量干預(yù)組（Oct200μg/kg・d腹腔注射，n=10），同等條件下層流室內(nèi)飼養(yǎng)35d.

1.2.3標(biāo)本檢測(cè)記錄每只動(dòng)物模型生存時(shí)間，死亡時(shí)體質(zhì)量，取肝臟，肺臟40g/L多聚甲醛，0.1mol/L磷酸緩沖液固定48h，組織石蠟包埋，HE染色，免疫組化方法檢測(cè)對(duì)比組間肝臟腫瘤組織MMP2表達(dá)變化.染色結(jié)果判定參照Mattern方法［1］：陽(yáng)性染色深度:未見染色為0，輕度染色(染成淺黃色)為1，中度染色(染成棕黃色)為2，深度染色(染成棕褐色)為3；陽(yáng)性細(xì)胞百分比:未見染色為0，染色細(xì)胞<25%為1，25%～50%為2，>50%為3.將這兩方面得分相加，得分0～2分判為陰性表達(dá)，>2分(3～6)判為陽(yáng)性表達(dá)，隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野，記數(shù)1000個(gè)細(xì)胞.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)計(jì)量結(jié)果以x±s表示,計(jì)量資料組間比較經(jīng)SAS軟件進(jìn)行方差分析及Dunnett檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法.

2結(jié)果

人高轉(zhuǎn)移潛能肝癌細(xì)胞株MHCC97H種植于裸鼠皮下，層流室飼養(yǎng)35d后發(fā)現(xiàn)原注射點(diǎn)皮下形成約1.1×0.9cm包塊，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呈現(xiàn)衰竭狀態(tài).動(dòng)物模型建立后，待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自然清醒，觀察3d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)靈敏，覓食積極，并未發(fā)現(xiàn)因出血和感染死亡動(dòng)物.動(dòng)物模型建立后10d發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組動(dòng)物模型較干預(yù)組動(dòng)物模型活動(dòng)減少，同時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)照組動(dòng)物模型死亡時(shí)體重明顯減輕（P＜0.01），生存時(shí)間組間對(duì)比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）,但是大劑量干預(yù)組動(dòng)物模型中位生存期較小劑量干預(yù)組延長(zhǎng)（26.7~21.5d），同時(shí)小劑量干預(yù)組動(dòng)物模型中位生存期較陰性對(duì)照組延長(zhǎng)（21.5~19.3d）.

肝臟病理改變可見兩種類型.A型肉眼見裸鼠肝體積明顯減小，色澤晦暗，質(zhì)地變硬，表面滿布1~2mm大小結(jié)節(jié)，呈“粟粒”樣，與正常肝臟組織分界不清.鏡下見裸鼠肝細(xì)胞大量變性壞死，組織結(jié)構(gòu)消失，正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失，殘存裸鼠肝細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)氣球樣改變，水腫明顯；腫瘤細(xì)胞胞核淡染，異型性明顯，聚集成團(tuán)，呈現(xiàn)“癌巢”狀，可見腫瘤細(xì)胞侵入管型結(jié)構(gòu).B型肉眼見裸鼠肝變化不明顯，色澤鮮紅，質(zhì)地柔軟，光滑，與正常肝臟組織分界明顯.鏡下見壞死區(qū)范圍明顯縮小，腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)“癌巢”改變，裸鼠殘存肝細(xì)胞腫脹壞死明顯減輕.肺臟病理改變：肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞聚集，并可見肺泡間質(zhì)內(nèi)腫瘤細(xì)胞聚集成團(tuán)，胞核淡染，異型性明顯.

陰性對(duì)照組87.5%動(dòng)物模型肝臟呈現(xiàn)“A”型形態(tài)改變，干預(yù)組77.8%動(dòng)物模型肝臟肉眼觀呈現(xiàn)“B”型形態(tài)改變，而且在大劑量干預(yù)組出現(xiàn)B型形態(tài)改變的動(dòng)物比例大于小劑量干預(yù)組（44.4%~100%）.肺臟組織連續(xù)切片HE染色判斷肝癌肺轉(zhuǎn)移率可見陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)移率87.5%，小劑量干預(yù)組轉(zhuǎn)移率33.3%，大劑量干預(yù)組轉(zhuǎn)移率10.0%（表1，P<0.05）.大劑量干預(yù)組MMP2表達(dá)明顯下調(diào)，陽(yáng)性表達(dá)腫瘤細(xì)胞幾乎不可見，在小劑量干預(yù)組MMP2表達(dá)較大劑量干預(yù)組表達(dá)上調(diào)，可見少量陽(yáng)性及弱陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，散在分布；在陰性對(duì)照組MMP2表達(dá)明顯較干預(yù)組強(qiáng)，可見陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn).而干預(yù)組間未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）.

表1組間動(dòng)物模型一般狀況(略)

aP<0.05vs陰性對(duì)照.

表2MMP2,MMP9在肝癌組織中的表達(dá)（略）

aP<0.05vs陰性對(duì)照.

3討論

HCC的高復(fù)發(fā)高轉(zhuǎn)移特性嚴(yán)重影響HCC的遠(yuǎn)期療效,部分腫瘤在體積很小時(shí)就已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，臨床就診者多屬中晚期，因此如何控制HCC的高侵襲性，降低復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率是當(dāng)今治療HCC的重點(diǎn).SS及其類似物對(duì)腫瘤的抑制作用近來(lái)受到關(guān)注.Oct為人工合成的生長(zhǎng)抑素類似物，臨床上發(fā)現(xiàn)Oct對(duì)多種實(shí)體腫瘤存在抑制作用，包括胃癌，肺癌，胰腺癌等［2］.隨著臨床研究的進(jìn)展，Oct被逐步應(yīng)用于HCC治療領(lǐng)域，眾多實(shí)驗(yàn)表明在人肝癌細(xì)胞表面存在SSTR表達(dá)［3］，而且這一現(xiàn)象已被利用于腫瘤的診斷［4-5］.

文獻(xiàn)報(bào)道［6］于裸鼠肝內(nèi)種植MHCC97H細(xì)胞株建立肝癌模型，飼養(yǎng)35d后，肝癌肺轉(zhuǎn)移率高達(dá)100%，而且MHCC97H細(xì)胞株體外連續(xù)培養(yǎng)傳代120余代，生物性狀保持穩(wěn)定，是研究肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的良好模型.試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在組間均衡性檢驗(yàn)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以及同樣的飼養(yǎng)條件下，陰性對(duì)照組動(dòng)物模型肝癌肺轉(zhuǎn)移87.5%，明顯高于小劑量干預(yù)組(33.3%)和大劑量干預(yù)組(10.0%)，Oct對(duì)肝癌肺轉(zhuǎn)移存在抑制作用.

MMP2在癌組織內(nèi)表達(dá)于肝癌細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈淡黃色至棕褐色細(xì)顆粒狀.MMP2陽(yáng)性細(xì)胞常散在分布，也有呈巢團(tuán)狀，在浸潤(rùn)灶前沿處MMP2表達(dá)加強(qiáng)，陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增多.而位于腫瘤邊緣、近血管處、浸潤(rùn)灶前沿等處腫瘤細(xì)胞常是高侵襲性克隆聚集處，提示MMP2可能于高侵襲性克隆中表達(dá)加強(qiáng).在組間比較中發(fā)現(xiàn)陰性對(duì)照組MMP2表達(dá)明顯強(qiáng)于干預(yù)組，干預(yù)組組間比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；MMP2主要降解作為基底膜的主要成分的Ⅳ型膠原、同時(shí)也具有降解明膠、Ⅶ和Ⅹ型膠原的能力，MMP2的異常高表達(dá)與腫瘤的惡性程度和腫瘤的血管生成呈正相關(guān)，二者均與腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Oct可以降低動(dòng)物模型肝癌轉(zhuǎn)移率，可能通過(guò)下調(diào)促轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2的表達(dá)得以實(shí)現(xiàn)，是其抑制HCC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一［7］.

【參考文獻(xiàn)】

［1］MatternJ,KoomagiR,VolmM.AssociationofvascularendothelialgrowthfactorexpressionwithintratumoralmieroveSSaldensityandtumoralproliferationinhumanepidermoidlungcarcinoma［J］.BrJCancer,1996,73(2):931-934.

［2］SmithAB,CharnleyAK,MesarosEF,etal.Design,Synthesis,andBindingAffinitiesofPyrrolinoneBasedSomatostatinMimetics［J］.OrgLett,2005,7(3):399-402.

［3］RadererM,HejnaMH,MullerC,etal.Treatmentofhepatocellularcancerwiththelongactingsomatostatinanaloglanreotideinvitroandinvivo［J］.IntJOncol,2000,16(6):1197-1201.

［4］MannavolaD,PersaniL,VannucchiG,etal.Differentresponsestochronicsomatostatinanaloguesinpatientswithcentralhyperthyroidism［J］.ClinEndocrinol(Oxf),2005,62(2):176-181.

［5］AcostaGomezMJ,MurosMA,etal.Theroleofsomatostatinreceptorscintigraphyinpatientswithpituitaryadenomaorpostsurgicalrecurrenttumours［J］.BrJRadiol,2005,78(926):110-115.

［6］LiY,TangY,YeL,etal.EstablishmentofahepatocellularcarcinomacelllinewithuniquemetastaticcharacteristicsthroughinvivoselectionandscreeningformetastasisrelatedgenesthroughcDNAmicroarray［J］.JCancerResClinOncol,2003,129(1):43-51.

［7］王賢輝,陳志南,郭曉楠,等.CD147分子與MMPs在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)的相關(guān)性［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2001;22(3):217-219.