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【關(guān)鍵詞】微透析；,,回收率；,,應(yīng)用

摘要：該文介紹了微透析取樣技術(shù)的原理，組成以及微透析探針的類型，對(duì)常用測(cè)定微透析探針回收率方法的優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較，綜述了近年來國(guó)內(nèi)外有關(guān)微透析技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展，顯示該項(xiàng)技術(shù)在研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：微透析；回收率；應(yīng)用

微透析(microdialysis)技術(shù)是將灌流取樣和透析技術(shù)結(jié)合起來并逐漸完善的一種新型生物采樣技術(shù),可在麻醉或清醒的生物體上使用,特別適合于深部組織和重要器官的活體生化研究。目前已成為實(shí)驗(yàn)神經(jīng)生理學(xué)和神經(jīng)化學(xué)的重要研究工具之一,它可提供遞質(zhì)釋放、攝取和代謝的必要信息。隨著微透析采樣和檢測(cè)靈敏度的不斷提高,微透析技術(shù)迅速發(fā)展起來,成為生物化學(xué)研究中一個(gè)引人注目的新領(lǐng)域。從20世紀(jì)90年代起這項(xiàng)技術(shù)在生命科學(xué)研究中進(jìn)入高潮。微透析取樣裝置主要由微量泵、微透析探頭、收集器、連接管及配套設(shè)備［1］組成。微量泵以注射泵為佳,有利于減少恒流泵和蠕動(dòng)泵的波動(dòng),流速一般為1~5μl/min。微透析探頭有直線性探頭、環(huán)形探頭、同心型探頭等不同的類型(微透析管因?qū)嶒?yàn)對(duì)象不同而形狀大小各異)；按照探頭的形狀分為穿顱探頭、U型探頭、I型探頭、環(huán)形探頭等（圖1）。目前普遍應(yīng)用的是同心型探頭，微透析探頭通常是由一管式半透膜與不銹鋼、石英或塑料毛細(xì)管構(gòu)成雙層管道；長(zhǎng)度一般為1～10cm。半透膜由再生纖維素、聚碳酸酯或聚丙烯腈制成（圖2）,載留分子量5～10KD不等。實(shí)際應(yīng)用需根據(jù)具體組織和待測(cè)物選擇不同的微透析探頭。

圖1探頭類型（略）

圖2微透析探針（略）

微透析主要原理是以透析原理作為基礎(chǔ),通過對(duì)插入生物體內(nèi)中的微透析探頭在非平衡條件下進(jìn)行灌流,物質(zhì)沿濃度梯度逆向擴(kuò)散，使被分析物質(zhì)穿過膜擴(kuò)散進(jìn)入透析管內(nèi),并被透析管內(nèi)連續(xù)流動(dòng)的灌流液不斷帶出,從而達(dá)到活體組織取樣的目的。微透析技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是可在基本上不干擾體內(nèi)正常生命過程的情況下進(jìn)行在體(invivo)、實(shí)時(shí)(realtime)和在線(online)取樣,特別適用于研究生命過程的動(dòng)態(tài)變化。微透析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是活體取樣、動(dòng)態(tài)觀察、定量分析、采樣量小、組織損傷輕等。該技術(shù)的另一大優(yōu)點(diǎn)是樣品的采集與分析過程既可在位又可離位進(jìn)行。此外微透析技術(shù)的獨(dú)到之處是可以單獨(dú)取得細(xì)胞外液,因此可對(duì)體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),具有重要的生物學(xué)意義。在國(guó)外已成功地用于測(cè)定細(xì)胞外液中的多種神經(jīng)遞質(zhì)［2］、氨基酸［3］、葡萄糖［4］、腺苷及其代謝產(chǎn)物［5］等小分子化合物。然而微透析技術(shù)一直困擾人們的問題就是如何對(duì)取出的樣品進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的校正，這就涉及到對(duì)探針的回收率的測(cè)定。探針回收率是指從灌流液中流出的待測(cè)組分與標(biāo)準(zhǔn)濃度之比的百分?jǐn)?shù)。探針回收率是影響微透析結(jié)果的重要因素,取決于取樣部位的生物學(xué)性質(zhì)、透析膜的物理性質(zhì)(材料、孔徑、長(zhǎng)度及幾何形狀等)、待測(cè)物質(zhì)的分子量、灌流速度、壓力、生物體本身的健康條件和生物節(jié)律等。目前測(cè)定回收率的方法主要有以下幾種：

1外標(biāo)法

只需要計(jì)算被測(cè)物質(zhì)相對(duì)濃度的變化時(shí),可簡(jiǎn)單地采用體外回收率法。測(cè)定宜在取樣后立即進(jìn)行,將探針放入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中,用與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相同的流速灌流探針。達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后收集灌流液并進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之比就是體外回收率。此法雖簡(jiǎn)單易行,但由于被測(cè)物質(zhì)在體外時(shí)與體內(nèi)的環(huán)境狀況不同,檢測(cè)結(jié)果不能嚴(yán)格地等同于實(shí)際的回收率。

2內(nèi)標(biāo)法

［6］是往灌流液中加入已知濃度且性質(zhì)與被分析物質(zhì)相似的另一種物質(zhì)做內(nèi)標(biāo),內(nèi)標(biāo)物不僅在擴(kuò)散性質(zhì)上與被分析物一致,而且還要在體內(nèi)的代謝過程中也盡可能一致,測(cè)出透析率即作為被分析物的回收率。由于選擇內(nèi)標(biāo)的局限性很大,限制了此法的應(yīng)用。

3反透析法

［7］假設(shè)被測(cè)物從兩個(gè)方向通過半透膜是同等的。在灌流液中加入一定濃度的內(nèi)標(biāo)物(Cic),在與體內(nèi)透析相同的條件下操作,測(cè)定透析液中內(nèi)標(biāo)物的濃度(Cec),體內(nèi)回收率(Rin,vivo)可用下式計(jì)算：Rinvivo=(1Cec/Cic)×100%本法要求內(nèi)標(biāo)物具有生物惰性,盡可能與被測(cè)物相似。

4低流速法

［8］低流速法是將灌流速度盡量降低,一般控制在50nl/min以下,使回收率盡量達(dá)到100%,此時(shí)便無需進(jìn)行回收率校正了。此法取樣體積很少(一般在5μl以下),不但對(duì)儀器的檢測(cè)靈敏度要求極高,而且取樣時(shí)間長(zhǎng)易造成樣品的揮發(fā)或氧化。此外還有外推至零流速法(extrapolationtozeroflow)［9］和零凈通量法(zero-netflux)［10］。微透析只是一項(xiàng)取樣技術(shù)，要進(jìn)行體內(nèi)物質(zhì)測(cè)定必須要與分析儀器聯(lián)用，以便于有利于對(duì)微量樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)和在線分析測(cè)定，減少操作誤差。微透析時(shí)選取適當(dāng)微透析膜的截留分子量,免除了復(fù)雜的樣品前處理及由此而產(chǎn)生的樣品損失和誤差,也不會(huì)因在室溫取樣而酶解,提高了樣品的穩(wěn)定性,使微透析液中可不含蛋白質(zhì)和酶等生物大分子,同時(shí)由于微透析取出的樣品體積小，約為μl級(jí)，易于揮發(fā)，因此取出后不易久放，能直接進(jìn)入分析儀器進(jìn)行測(cè)定。常用的有高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)、質(zhì)譜（MS）及激光誘導(dǎo)的熒光檢測(cè)器等,可從容地進(jìn)行分離和測(cè)定。利用微透析技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)主要是在被限制動(dòng)物或麻醉動(dòng)物身上，也可用于自由活動(dòng)的清醒動(dòng)物，應(yīng)用最多的腦功能的研究，近年來該技術(shù)的應(yīng)用已取得很多的科研成果。腦：在顱內(nèi)手術(shù)，Hutchinson等［11］利用微透析方法與其他監(jiān)測(cè)手段研究動(dòng)脈瘤手術(shù)的情況,得出:患者穩(wěn)定期腦氧壓2.0~6.0kPa(15~45mmHg)之間；葡萄糖含量在0.5~3mmol/L之間,乳酸/丙酮酸比值＞30，在32~65之間則暗示有厭氧代謝,3min＜的短暫夾閉不會(huì)引起腦氧量減少或乳酸/葡萄糖比值的升高；長(zhǎng)時(shí)間夾閉則會(huì)有副作用。萬登峰［12］等應(yīng)用微透析技術(shù)動(dòng)態(tài)收集大鼠輕、重度腦損傷局部的細(xì)胞外液(ECF)透析液,觀察其葡萄糖含量(［Glu］d)和乳酸含量(［Lac］d)變化。透析管插入引起［Glu］d和［Lac］d的變化很小(P＜0.05)；腦損傷后［Glu］d下降，與對(duì)照組及損傷前相比相差顯著(P＜0.05)，且損傷越重其變化越顯著(P＜0.05)；而腦損傷后［Lac］d則上升，與對(duì)照組及損傷前相比相差顯著(P＜0.05)，且損傷越重其變化亦越顯著(P＜0.05)；腦損傷后［Glu］d和［Lac］d的變化分別與腦組織含水量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)和顯著正相關(guān)(P＜0.05)。皮膚：Sjogren等［13］選用聚乙烯砜膜(100kD)探針測(cè)定皮膚在探針插入這一微創(chuàng)條件下白介素-6的產(chǎn)生,為測(cè)定復(fù)雜的細(xì)胞因子系統(tǒng)提供了技術(shù)參考。金屬離子與一些皮膚病的發(fā)病有關(guān),但活體皮膚離子濃度測(cè)定一直較難實(shí)施,Leveque等［14］以該技術(shù)聯(lián)用原子吸收光度計(jì)測(cè)定真皮鐵離子濃度,證實(shí)微透析可用于皮膚離子測(cè)定。此外還可進(jìn)行血液、脂肪、肌肉中藥物濃度的變化。由于物質(zhì)跨膜擴(kuò)散是雙向性的，微透析技術(shù)除了可用于監(jiān)測(cè)體內(nèi)環(huán)境的生化改變外,還可作為一種給藥途徑。可將藥物緩慢、直接地作用于靶器官，提高藥效分析和藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究的水平，特別是局部直接給藥更能顯示出這種方法的優(yōu)越性。陽曉等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)性大鼠的腹透液中加入川芎嗪長(zhǎng)期進(jìn)行腹膜透析(PD)，腹膜間皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完好,間皮下無明顯的基質(zhì)沉積，且大鼠PD的超濾量顯著提高，小分子物質(zhì)的清除率增加,而對(duì)透出液中蛋白質(zhì)濃度則無明顯影響。微透析技術(shù)已用于測(cè)定直接人腦實(shí)質(zhì)的藥物濃度［16］，并可幫助諸如愛滋病毒（HIV）感染病人選擇合適的穿透血腦屏障的藥物。但微透析技術(shù)仍存在一些不足，微透析技術(shù)的不足之處在于探針的植入會(huì)造成局部輕微的損傷。特別是對(duì)急性實(shí)驗(yàn)可能有一定程度的影響?；厥章实臏y(cè)定雖然種類繁多,但每種方法都不夠完善,影響了實(shí)際濃度的計(jì)算。由于采用的方法不同在檢測(cè)濃度極低的生理活性物質(zhì)時(shí)不同作者的報(bào)告有時(shí)可能相差近一個(gè)數(shù)量級(jí)。微透析技術(shù)要求探頭必須準(zhǔn)確插在同一取樣部位,因此不適合對(duì)很小的腦內(nèi)神經(jīng)核團(tuán)采樣。由于透析膜體積小,灌流液的流速低(一般1～5μl/min),很難進(jìn)行以秒為單位的動(dòng)態(tài)觀察。

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